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一般來說,實時PCR協(xié)議與標準PCR反應(yīng)類似。在生產(chǎn)清潔模板、設(shè)計引物、優(yōu)化反應(yīng)條件等方面也有同樣的問題。主要的區(qū)別是加入插層劑,如SYBR綠色或使用熒光引物檢測PCR產(chǎn)物。在典型反應(yīng)中,qPCR產(chǎn)物呈指數(shù)級生成。由于要使足夠的產(chǎn)品易于檢測,需要幾個周期,熒光圖與循環(huán)數(shù)圖顯示出乙狀結(jié)腸的外觀。在后期,反應(yīng)底物逐漸枯竭,qPCR產(chǎn)物不再加倍,曲線開始平坦。熒光量開始迅速增加的曲線上的點,通常是基線上方的一些標準偏差。Ct與模板的曲線呈線性關(guān)系,因此,通過比較多個反應(yīng)之間的Ct值,可以計算目標核酸的濃度。
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